Ero geenikloonauksen ja PCR n välillä

Keskeinen ero - geenikloonaus vs. PCR
 

Monien DNA-kopioiden synteesiä spesifisestä DNA-fragmentista kutsutaan DNA-monistukseksi. DNA: n monistamisprosesseja on kaksi, nimittäin geenikloonaus ja PCR. Avainero geenikloonauksen ja PCR: n välillä on, geenikloonaus tuottaa tietyn geenin useita kopioita in vivo rakentamalla rekombinantti-DNA ja kasvamalla isäntäbakteerin sisällä, kun taas PCR tuottaa miljoonia kopioita spesifisestä DNA-fragmentista in vitro toistuvat denaturointi- ja synteesisyklit.

SISÄLLYS
1. Yleiskatsaus ja keskeiset erot
2. Mikä on geenikloonaus
3. Mikä on PCR
4. Vertailu rinnakkain - geenikloonaus vs. PCR
5. Yhteenveto

Mikä on geenikloonaus?

Geenikloonaus on tekniikka, jota käytetään spesifisen geenin paikantamiseen ja monistamiseen organismin uutetusta genomisesta DNA: sta rekombinantti-DNA: n rakentamisen avulla. Genomi-DNA sisältää tuhansia erilaisia ​​geenejä, jotka on koodattu proteiineille. Kun DNA uutetaan, se sisältää kaikki mahdolliset geenit, joita se voi kantaa. Geenikloonaustekniikka on mahdollistanut spesifisen geenin havaitsemisen kokonais-DNA: sta. Siksi geenikloonaus on tärkeä työkalu molekyylibiologiassa.

Organismin genomikirjaston tekeminen on välttämätöntä geenikloonauksessa, jos asiaan liittyvän geenin sijainnista DNA: ssa ei ole ymmärrystä. Genomikirjasto tehdään seuraavien vaiheiden avulla.

Vaihe 1: Kokonais-DNA: n uutto organismista, joka sisältää halutun geenin.

Vaihe 2: Uutetun DNA: n pilkkomisen rajoittaminen pienten hallittavien fragmenttien tuottamiseksi. Tätä vaihetta helpottavat restriktioendonukleaasit.

Vaihe 3: Sopivan vektorin valinta ja vektorin DNA: n avaaminen käyttämällä samoja restriktioendonukleaaseja. Bakteeriplasmideja käytetään yleisesti vektoreina vieraan DNA: n kuljettamiseksi. Plasmidit ovat pieniä DNA-piirejä, jotka sijaitsevat bakteereissa.

Vaihe 4: Vektori-DNA: n ja fragmentoidun DNA: n yhdistäminen yhdistelmä-DNA-molekyylin tuottamiseksi. Tätä vaihetta säätelee DNA-ligaasi.

Vaihe 5: Rekombinantti-DNA-molekyylien siirtäminen isäntäbakteereiksi. Tätä vaihetta kutsutaan muunnokseksi ja se suoritetaan käyttämällä lämpöiskua.

Vaihe 5: Transformoitujen bakteerisolujen seulonta viljelyalustalla. Transformoituneiden ja ei-transformoituneiden isäntäsolujen sekapopulaatio saadaan transformaatioprosessin lopussa. Koska mielenkiinnon kohteena oleva geeni sisältää vain transformoidut isäntäsolut. Siksi on välttämätöntä valita transformoidut solut. Valinta tehdään selektiivisillä väliaineilla, jotka sisältävät antibiootteja. Vain transformoidut solut kasvavat tällä seulontaväliaineella mahdollistaen selektion.

Vaihe 6: Bakteerien kasvatus geenikirjaston tuottamiseksi. Tässä vaiheessa transformoidut isäntäsolut viedään tuoreisiin viljelyalustoihin, jotka tuottavat optimaaliset kasvun vaatimukset. Viljelylevyjen kokonaispesäkkeet edustavat kyseisen organismin genomikirjastoa.

Vaihe 7: Kiinnostavan geenin sisältävä rekombinantti-DNA-molekyyli on seulottava tuhansista rekombinantti-DNA: n kloonattuista fragmentista. Se voidaan suorittaa käyttämällä koettimia, jotka merkitsevät spesifistä geeniä tai spesifinen proteiini johtaa tästä geenistä.

Kun kiinnostettu bakteeripesäke sisältävä geeni on tunnistettu kokonaispesäkkeistä, on mahdollista tehdä miljoonia kopioita rekombinanttiplasmidista, joka sisältää geenin.

Geenikloonausta käytetään geenikirjastojen perustamiseen, erityisten proteiinien, vitamiinien, antibioottien, hormonien tuottamiseen, organismien genomien sekvensointiin ja kartoittamiseen, yksilöllisen DNA: n kopioiden tekemiseen rikosteknisissä tutkimuksissa jne..

Kuvio_1: geenikloonaus

Mikä on PCR?

Polymeraasiketjureaktio (PCR) on tekniikka, joka tuottaa suuren määrän kopioita tietystä DNA-fragmentista. Spesifisen DNA-sekvenssin eksponentiaalinen monistus saadaan PCR: llä kohdassa in vitro olosuhteissa. Tämä tekniikka on erittäin tehokas työkalu molekyylibiologiassa, koska se voi kertoa pienen näytteen DNA: sta käyttökelpoiseen määrään. Kary Mullis esitteli PCR: n vuonna 1983, ja palkittu keksintö loi valtavan edistyksen molekyylibiologiassa.

PCR-tekniikka seuraa toistuvia PCR-reaktioita, kuten kuviossa 02. Yksi PCR-reaktio koostuu kolmesta päävaiheesta, jotka tapahtuvat kolmessa eri lämpötilassa; kaksijuosteisten denatointi DNA: ssa 94 ° C: ssa ⁰C, alukkeiden hehkutus 68 ° C: ssa ⁰C- ja juostepidennys 72 ° C: ssa ⁰C. Siksi, kun suoritetaan PCR, lämpötilan vaihtelut tulisi ylläpitää voimakkaasti oikean replikaation aikaansaamiseksi. PCR suoritetaan PCR-koneessa PCR-putkien sisällä. PCR-putket lastataan oikeilla PCR-seoksilla, jotka sisältävät templaatti-DNA: ta, Taq-polymeraasia, alukkeita, dNTP: tä ja puskuria. Kaksijuosteisen näyte-DNA: n denaturointi yksijuosteiseksi DNA: ksi tehdään hajottamalla vety sidokset komplementaaristen emästen välillä 94 - 98 ⁰C. Sitten templaatti-DNA: n yksittäiset juosteet altistetaan alukkeille. Aluksen tulisi olla pari (eteenpäin ja taaksepäin), ja niiden tulisi olla lämpöstabiileja korkeiden lämpötilojen sietämiseksi. Alukkeet ovat yksijuosteisia lyhyitä DNA-sekvenssejä, jotka ovat komplementaarisia kohde-DNA-fragmentin päille. PCR: ssä käytetään synteettisiä alukkeita. Alukkeet sitoutuvat näytteen DNA: n komplementaarisilla emäksillä ja käynnistävät uuden juosteen synteesin. Tätä vaihetta katalysoi entsyymi, nimeltään Taq-polymeraasi; lämpöstabiili DNA-polymeraasientsyymi, joka on eristetty Thermus auqaticus. Kun alukkeita ja nukleotidejä (rakennuspalikoita) on saatavana, Taq-polymeraasi rakentaa uuden DNA-juosteen, joka on komplementaarinen templaatti-DNA: lle. PCR-ohjelman lopussa monistettu DNA-fragmentti havaitaan geelielektroforeesilla. Jos tarvitaan lisätutkimuksia, PCR-tuote puhdistetaan geelistä.

PCR on erittäin hyödyllinen geneettisten ja hankittujen sairauksien diagnosoinnissa ja seurannassa, rikollisten tunnistamisessa (oikeuslääketieteen alalla), kohde-DNA-segmentin rakenteen ja toiminnan tutkimisessa, organismien genomien sekvensoinnissa ja kartoittamisessa jne. PCR: stä on tullut rutiininomainen laboratoriotekniikka lääkäreiden ja molekyylibiologian tutkimuslaboratorioissa tutkijoiden keskuudessa, koska sillä on laaja valikoima sovelluksia.

Kuvio_2: polymeraasiketjureaktio

Mikä on ero geenikloonauksen ja PCR: n välillä??

Geenikloonaus vs. PCR
Geenikloonaus on prosessi, jolla valmistetaan useita kopioita tietystä geenistä in vivo rekombinantti-DNA: n kautta ja transformoituna isäntäbakteereiksi.	PCR-tekniikka tuottaa useita kopioita tietystä DNA-sekvenssistä in vitro toistuvien PCR-reaktioiden jaksojen kautta.
Rekombinantti-DNA: n rakentamisen vaatimus
Rekombinantti-DNA: ta tuotetaan geenin paikantamiseksi.	Rekombinantti-DNA: ta ei tuoteta.
Työvoiman tarve
Tämä prosessi on työvaltainen.	Intensiivistä työvoimaa ei tarvita.
In vivo tai in vitro -prosessi
Yhdistelmä-DNA: n rakentaminen on in vitro ja DNA: n monistus on in vivo.	DNA: n monistus tapahtuu täysin in vitro.

Yhteenveto - geenikloonaus vs. PCR

Geenikloonaus ja PCR ovat kaksi menetelmää, joita käytetään DNA-monistukseen. PCR on in vitro prosessi, joka tekee useita kopioita tietyn DNA-fragmentin DNA: sta käyttämättä yhdistelmä-DNA: ta ja isäntäorganismia. Geenikloonaus on ensisijaisesti in vivo prosessi, joka johtaa moniin kopioihin kiinnostuneesta geenistä isäntäorganismin sisällä rakentamalla rekombinantti-DNA: ta. Tämä on ero geenikloonauksen ja PCR: n välillä.

Viite:
1. Griffiths, Anthony JF. "Tietty geenin kloonaus." Nykyaikainen geneettinen analyysi. Yhdysvaltain kansallinen lääketieteellinen kirjasto, 1. tammikuuta 1999. Web. 22. helmikuuta 2017
2. ”Polymeraasiketjureaktio (PCR).” Kansallinen bioteknologiatietokeskus. Yhdysvaltain kansallinen lääketieteellinen kirjasto, n.d. Web. 22. helmikuuta 2017

Kuvan kohteliaisuus:
1. “Kuva 17 01 06” kirjoittanut CNX OpenStax - (CC BY 4.0) Commons Wikimedian kautta
2. ”PCR” - Madprime - Oma työ (CC BY-SA 3.0) Commons Wikimedian kautta