Ero Sanger-sekvensoinnissa ja pyrosekvensoinnissa

Keskeinen ero - Sangerin sekvensointi vs. pyrosekvensointi
 

DNA-sekvensointi on erittäin tärkeä DNA-analyysille, koska tieto oikeasta nukleotidien järjestelystä tietyllä DNA-alueella paljastaa monia tärkeitä tietoja siitä. DNA-sekvensointimenetelmiä on erilaisia. Sanger-sekvensointi ja pyrosekvensointi ovat kaksi erilaista DNA-sekvensointimenetelmää, joita käytetään laajasti molekyylibiologiassa. Keskeinen ero Sanger-sekvensoinnin ja Pyrosequencing-tekniikan välillä on se Sanger-sekvensointi käyttää dideoksinukleotidejä DNA: n synteesin lopettamiseen nukleotidisekvenssin lukemiseksi, kun taas pyrosekvensointi havaitsee pyrofosfaatin vapautumisen sisällyttämällä nukleotidit ja syntetisoimalla komplementaarisen sekvenssin sekvenssin tarkan järjestyksen lukemiseksi.

SISÄLLYS
1. Yleiskatsaus ja keskeiset erot
2. Mikä on Sanger-sekvensointi
3. Mikä on pyrosekvensointi
4. Vertailu rinnakkain - Sanger-sekvensointi vs. pyrosekvensointi
5. Yhteenveto

Mikä on Sanger-sekvensointi?

Sanger-sekvensointi on ensimmäisen sukupolven DNA-sekvensointimenetelmä, jonka Frederick Sanger ja hänen korkeakoulut ovat kehittäneet vuonna 1977. Se tunnetaan myös nimellä Ketjun lopettamisen sekvensointi tai Dideoksi-sekvensointi koska se perustuu dideoksinukleotidien (ddNTP) ketjun päättämiseen. Tätä menetelmää käytettiin laajasti yli 30 vuotta, kunnes kehitettiin uuden sukupolven sekvensointi (NGS). Sanger-sekvensointitekniikka mahdollisti oikean nukleotidijärjestyksen tai tietyn DNA-fragmentin kiinnittymisen löytämisen. Se perustuu ddNTP: ien selektiiviseen sisällyttämiseen ja DNA-synteesin lopettamiseen in vitro DNA kopiointi. 3'OH-ryhmien puuttuminen fosfodiesterisidosten muodostumisen jatkamiseksi vierekkäisten nukleotidien välillä on ddNTP: n ainutlaatuinen piirre. Siksi, kun ddNTP on kiinnitetty, ketjun venymä loppuu ja päättyy siitä kohdasta. Sanger-sekvensoinnissa käytetään neljä ddNTP: tä - ddATP, ddCTP, ddGTP ja ddTTP. Nämä nukleotidit pysäyttävät DNA: n replikaatioprosessin, kun ne sisällytetään kasvavaan DNA-juosteeseen ja johtavat lyhyen DNA: n vaihteleviin pituuksiin. Kapillaarigeelielektroforeesia käytetään organisoimaan nämä lyhyet DNA-juosteet niiden koon mukaan geeliin, kuten kuvassa 01 esitetään.

Kuvio 1: Syntetisoidun lyhyen DNA: n kapillaarigeelielektroforeesi

varten in vitro DNA: n kopiointi, muutamia vaatimuksia olisi annettava. Ne ovat DNA-polymeraasientsyymiä, templaatti-DNA: ta, oligonukleotidialukkeita ja deoksinukleotideja (dNTP). Sanger-sekvensoinnissa DNA-replikaatio suoritetaan neljässä erillisessä koeputkessa yhdessä neljän tyypin ddNTP: ien kanssa erikseen. Deoksinukleotidejä ei korvata täysin vastaavilla ddNTP: llä. Seos tietystä dNTP: stä (esimerkiksi; dATP + ddATP) sisällytetään putkeen ja replikoidaan. Neljä erillistä putkituotetta ajetaan geelillä neljässä erillisessä kuopassa. Sitten lukemalla geeli, sekvenssi voidaan rakentaa kuvan 02 mukaisesti.

Kuva 02: Sanger-sekvensointi

Sanger-sekvensointi on tärkeä tekniikka, joka auttaa monilla molekyylibiologian aloilla. Ihmisen genomiprojekti saatiin onnistuneesti päätökseen Sangerin sekvensointipohjaisten menetelmien avulla. Sanger-sekvensointi on hyödyllistä myös kohde-DNA-sekvensoinnissa, syövän ja geneettisten sairauksien tutkimuksessa, geeniekspressioanalyysissä, ihmisen tunnistamisessa, patogeenien havaitsemisessa, mikrobien sekvensoinnissa jne..

Sanger-sekvensoinnilla on useita haittoja:

• Sekvensoitavan DNA: n pituus ei voi olla pidempi kuin 1000 emäsparia
• Vain yksi juoste voidaan sekvensoida kerrallaan.
• Prosessi on aikaa vievä ja kallis.

Siksi uusia edistyneitä sekvensointitekniikoita kehitettiin ajan myötä näiden ongelmien voittamiseksi. Sanger-sekvensointi on kuitenkin edelleen käytössä sen erittäin tarkkojen tulosten takia, jopa noin 850 emäsparin pituisiin fragmentteihin.

Mikä on pyrosekvensointi?

Pyrosekvensointi on uusi DNA-sekvensointitekniikka, joka perustuu ”sekvensointiin synteesillä”. Tämä tekniikka perustuu pyrofosfaatin vapautumisen havaitsemiseen nukleotidin sisällyttämisen yhteydessä. Prosessia käyttävät neljä erilaista entsyymiä: DNA-polymerse, ATP-sulfurylaasi, lusiferaasi ja apyrase ja kaksi substraattia adenosiini-5'-fosfosulfaatti (APS) ja lusiferiini.

Prosessi alkaa alukkeen sitoutumisella yksijuosteiseen DNA-templaattiin ja DNA-polymeraasi aloittaa siihen komplementaaristen nukleotidien sisällyttämisen. Kun nukleotidit yhdistyvät (nukleiinihappopolymerointi), se vapauttaa pyrofosfaatti (kaksi fosfaattiryhmää sitoutuneena toisiinsa) ryhmiä ja energiaa. Jokainen nukleotidilisäys vapauttaa ekvimolaarisen määrän pyrofosfaattia. Pyrofosfaatti muuttuu ATP: ksi ATP-sulfurylaasilla substraatin APS läsnä ollessa. Syntynyt ATP johtaa lusiferaasin välittämään lusiferiinin muuttumiseen oksisulfiferiiniksi tuottaen näkyvää valoa määrissä, jotka ovat verrannollisia ATP: ien määrään. Valo havaitaan fotonintunnistuslaitteella tai moninkertaistimella ja luo pyrogrammin. Apyraasi hajottaa ATP: tä ja sisällyttämättömiä dNTP: itä reaktioseoksessa. dNTP-lisäys tehdään kerran kerrallaan. Koska nukleotidin lisäys tunnetaan valon sisällyttämisen ja havaitsemisen mukaisesti, templaatin sekvenssi voidaan määrittää. Pyrogrammia käytetään näytteen DNA: n nukleotidisekvenssin luomiseen, kuten kuvassa 03 esitetään.

Pyrosekvensointi on erittäin tärkeä yksittäisen nukleotidin polymorfismin analyysissä ja lyhyiden DNA-osien sekvensoinnissa. Suuri tarkkuus, joustavuus, automatisoinnin helppous ja rinnakkaiskäsittely ovat pyrosekvensoinnin etuja Sanger-sekvensointitekniikoihin nähden.

Kuva 03: Pyrosekvensointi

Mitä eroa on Sanger-sekvensoinnilla ja pyrosekvensoinnilla??

Sanger-sekvensointi vs. pyrosekvensointi
Sanger-sekvensointi on DNA-sekvensointimenetelmä, joka perustuu ddNTP: ien selektiiviseen sisällyttämiseen DNA-polymeraasin avulla ja ketjun päättämiseen.	Pyrosekvensointi on DNA-sekvensointimenetelmä, joka perustuu pyrofosfaatin vapautumisen havaitsemiseen nukleotidin sisällyttämisen yhteydessä.
DdNTP: n käyttö
ddNTP: iä käytetään DNA-replikaation lopettamiseen	ddNTP: tä ei käytetä.
Entsyymit mukana
Käytetään DNA-polymeraasia.	Käytetään neljää entsyymiä: DNA-polymeraasi, ATP-sulfurylaasi, lusiferaasi ja apyraasi.
Käytetyt alustat
APS: tä ja Luciferiinia ei käytetä.	Adenosiini-5'-fosfosulfaattia (APS) ja lusiferiiniä käytetään.
Suurin lämpötila
Tämä on hidas prosessi.	Tämä on nopea prosessi.

Yhteenveto - Sanger-sekvensointi vs. pyrosekvensointi

Sanger-sekvensointi ja pyrosekvensointi ovat kaksi DNA-sekvensointimenetelmää, joita käytetään molekyylibiologiassa. Sanger-sekvensointi rakentaa nukleotidien järjestyksen peräkkäin lopettamalla ketjun pidentymisen, kun taas pyrosekvensointi rakentaa nukleotidien tarkan järjestyksen peräkkäin sisällyttämällä nukleotidit ja havaitsemalla pyrofosfaattien vapautumisen. Siksi tärkein ero Sangerin sekvensoinnin ja pyrosekvensoinnin välillä on se, että Sangerin sekvensointi toimii sekvensoinnissa ketjun päättämisellä, kun taas pyrosekvensointi toimii sekvensoinnissa synteesillä.

Viite:
1. Fakruddin, Md ja Abhijit Chowdhury. "Pyrosequencing-vaihtoehto perinteiselle sanger-sekvensoinnille." American Journal of Biochemistry and Biotechnology. Tiedejulkaisut, 2. maaliskuuta 2012. Web. 28. helmikuuta 2017.
2. ”Sanger-sekvensointi.” Sanger-sekvensointi - ScienceDirect-aiheet. N.p., n.d. Web. 28. helmikuuta 2017

Kuvan kohteliaisuus:
1. Christoph Goemans (modifiziert) “Didesoxy-Methode” - Dr. Norman Mauder, auf Basin einer Datei von Christoph Goemans (CC BY-SA 3.0) Commons Wikimediassa
2. ”Sanger-DNA-seq” Enzo puolan kielen Wikipediassa (CC BY-SA 3.0) Commons Wikimedian kautta
3. ”Pyrosekvensointi” mikrobiologiatavuilla (CC BY-SA 2.0) Flickrin kautta